10月27日，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院于濤課題組的最新研究成果以“Metabolic reconfiguration enable synthetic reductive metabolism in yeast”為題發(fā)表于Nature Metabolism。研究團隊通過理性設(shè)計，組合磷酸戊糖循環(huán)、轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈三個模塊，在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了一個合成能量系統(tǒng)，其可以支持細(xì)胞生長和高還原性化合物的生產(chǎn)，并實現(xiàn)40%的自由脂肪酸產(chǎn)率，為目前釀酒酵母研究的最高水平。
該成果由中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院于濤實驗室與查爾姆斯理工大學(xué)Jens Nielsen實驗室合作共同完成，于濤研究員為第一作者兼共同通訊作者，深圳先進技術(shù)研究院博士生王湘，研究助理劉香健也為研究作出重要貢獻。
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于濤團隊致力于利用合成生物學(xué)方法，解決可持續(xù)制造、綠色能源的生物存儲與糧食安全等重大問題。前期工作中，團隊成功實現(xiàn)了空氣中CO2到葡萄糖與脂肪酸的制備（Nature Catalysis，2022），本工作開發(fā)的合成的能量系統(tǒng)（細(xì)胞雙引擎），進一步提高了脂肪酸的轉(zhuǎn)化率，并為下一步開發(fā)可再生能源的生物儲能技術(shù)打下了基礎(chǔ)。
細(xì)胞在生長過程中合成大分子、構(gòu)建碳骨架，這些過程消耗能量，且需要克服底物和生物量之間的還原度差異。對于脂質(zhì)等高價值的儲能化合物，其還原度遠(yuǎn)高于葡萄糖等底物，細(xì)胞往往需要額外的還原力和能量來合成這些化合物。而這無疑需要對細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)進行重構(gòu)，因為細(xì)胞獲取能量和還原力、合成大分子和構(gòu)建碳骨架的目的是為自身生長，而不是產(chǎn)品合成。因此，研究者們構(gòu)想，是否有可能從頭構(gòu)建一個合成的能量系統(tǒng)，其是否可以取代內(nèi)源的能量系統(tǒng)為細(xì)胞供應(yīng)能量支撐生長？其是否能為化學(xué)品合成提供額外的能量和還原力？細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)高度協(xié)作，胞內(nèi)的能量和物質(zhì)組成維持在一定的比例，細(xì)胞是否能接受過量的NADPH和NADH？
研究團隊通過理性重排還原代謝，在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了一個新型合成能量系統(tǒng)，利用重復(fù)的單脫羧反應(yīng)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)實現(xiàn)NADPH和NADH的合成，并進一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰窟M行釋放。該系統(tǒng)由三個模塊組成：磷酸戊糖（Pentose Phosphate，PP）循環(huán)、轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈（圖1）。
圖1：合成能量系統(tǒng)示意圖
PP循環(huán)與轉(zhuǎn)氫循環(huán)的構(gòu)建
重復(fù)脫羧是細(xì)胞還原代謝的基礎(chǔ)，因此要構(gòu)建一個新的能量系統(tǒng)首先就是要構(gòu)建一個重復(fù)脫羧循環(huán)。磷酸戊糖途徑中，6-磷酸葡萄糖（G6P）被催化為5-磷酸核糖（R5P）時失去一分子CO2，生成2分子NADPH，此為氧化階段；之后C5分子經(jīng)可逆重排，最終重構(gòu)為6-磷酸果糖（F6P）和3-磷酸甘油醛（G3P），此為非氧化階段；G3P經(jīng)部分糖異生途徑可以回到G6P，再一次進入氧化階段，這樣就構(gòu)成了PP 循環(huán)。在這個循環(huán)中，1分子葡萄糖徹底氧化可以生成12分子NADPH。NADPH是細(xì)胞內(nèi)的還原力通量，而NADH經(jīng)過氧化呼吸鏈可以生成ATP。研究者過表達酵母內(nèi)源谷氨酸鹽轉(zhuǎn)氫酶GDH1和GDH2，在胞質(zhì)內(nèi)實現(xiàn)1分子NADPH不可逆轉(zhuǎn)變?yōu)?分子NADH的轉(zhuǎn)氫循環(huán)（圖2a）。
研究者選擇了一株消除葡萄糖效應(yīng)的丙酮酸脫羧酶缺陷菌株E1B[1]（重命名為SynENG001）來測試PP循環(huán)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)的碳通量。該菌株以氧化磷酸化為主要供能過程，可以在單一葡萄糖碳源上生長，且具有較好的胞質(zhì)NADH平衡能力。研究者敲除了磷酸果糖異構(gòu)酶基因pgi1，打斷了糖酵解途徑，提高了PP循環(huán)碳通量，得到的菌株SynENG064不能以糖為單一碳源生長；而在添加轉(zhuǎn)氫循環(huán)后，得到的菌株SynENG065在5天內(nèi)可以生長到OD600 nm=10（圖2b）。由此可推測敲除pgi后胞內(nèi)的NADPH過量，對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制。在野生型酵母內(nèi)敲除pgi并過表達GDH2僅能部分恢復(fù)細(xì)胞生長，研究者推測這是由于轉(zhuǎn)氫循環(huán)產(chǎn)生的過量NADH抑制細(xì)胞生長，因此細(xì)胞需要一個有效的呼吸鏈來解除胞質(zhì)內(nèi)多余的NADH。以上結(jié)果證實PP循環(huán)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)運行良好，且兩個模塊有較高的碳通量。
圖2：通過轉(zhuǎn)氫循環(huán)解除NADPH過量產(chǎn)生的毒性。a. PP循環(huán)和不可逆的轉(zhuǎn)氫循環(huán)。b. 轉(zhuǎn)氫循環(huán)恢復(fù)了pgi1缺失導(dǎo)致的生長缺陷。SynENG064菌株敲除了pgi1，SynENG065菌株敲除pgi1同時過表達了GDH1和GDH2（轉(zhuǎn)氫循環(huán)）
琥珀酸是一種四碳二羧酸，從丙酮酸合成琥珀酸需要細(xì)胞提供額外的還原力NADH。研究者在SynENG001菌株中過表達了琥珀酸合成所需要的各基因，并下調(diào)了磷酸果糖激酶（PFK）的表達水平推動碳流更多流向PP循環(huán)，使琥珀酸的產(chǎn)量升至約3.3 g/L（圖3）。在此過程中研究者還發(fā)現(xiàn)了甘油的積累，這些都說明PP循環(huán)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的NADH過剩。
圖3.合成能量系統(tǒng)產(chǎn)生過量NADH供給高還原度化學(xué)品合成。a. 磷酸果糖激酶下調(diào)的PP循環(huán)示意圖。b. PP循環(huán)結(jié)合轉(zhuǎn)氫循環(huán)提高了琥珀酸的生產(chǎn)。c. PP循環(huán)結(jié)合轉(zhuǎn)氫循環(huán)提高了甘油的生產(chǎn)
研究者模擬線粒體內(nèi)的氧化呼吸鏈，表達了兩種外部NADH脫氫酶NDE1和NDE2，將胞質(zhì)NADH與線粒體電子傳遞鏈聯(lián)系起來，得到菌株SynENG012（圖4a-b）。在下調(diào)TCA循環(huán)關(guān)鍵基因異檸檬酸脫氫酶IDH2的表達水平時，細(xì)胞生長逐漸受損乃至致死；放入合成能量系統(tǒng)（轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈）后，細(xì)胞生長不受影響（圖4c-d）。這些說明合成能量系統(tǒng)可以替代胞內(nèi)原有能量系統(tǒng)發(fā)揮作用，支持細(xì)胞生長。
圖4.合成能量系統(tǒng)支持細(xì)胞生長。a. 雙能量引擎設(shè)計示意圖。b. 雙能量系統(tǒng)的過度脫羧導(dǎo)致細(xì)胞生長受損。c. 無合成能量系統(tǒng)時，TCA循環(huán)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞生長受損。d. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持細(xì)胞生長
利用合成能量系統(tǒng)促進脂質(zhì)生產(chǎn)
自然界的產(chǎn)油真菌中線粒體內(nèi)的異檸檬酸脫氫酶受損會導(dǎo)致油脂的過度生產(chǎn)，因此先前的研究中，研究者在已優(yōu)化的產(chǎn)自由脂肪酸（Free Fatty Acids，F(xiàn)FAs）菌株動態(tài)調(diào)控IDH2的表達，得到菌株Y&Z032[2]。但是搖瓶發(fā)酵后細(xì)胞生長和FFAs產(chǎn)量都下降了。研究者推測這是由于胞內(nèi)能量供應(yīng)不足，因此放入了轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈，得到的菌株SynENG024生物量相對提高100%，F(xiàn)FA產(chǎn)量提高200%（圖5a-c）。這也進一步印證了合成能量系統(tǒng)可以支持細(xì)胞生長和高還原性化合物的生產(chǎn)。
此外，研究者還過表達不同來源的果糖-1,6-二磷酸酶FBP1來提高NADPH供應(yīng)（圖5d）；使用不同的啟動子微調(diào)NADPH和ATP的比例，但并未觀察到FFAs產(chǎn)量的明顯提高。因此在胞內(nèi)表達了非氧化糖酵解（Non-oxidative glycolysis，NOG）途徑，將PP途徑部分分流到乙酰輔酶A的合成。如預(yù)期所料，F(xiàn)FAs產(chǎn)量提高了30%（圖5e）。這說明最優(yōu)生產(chǎn)需要結(jié)合多策略實現(xiàn)。
分批補料發(fā)酵實驗中，研究者在FFAs生產(chǎn)的最佳菌株SynENG050中恢復(fù)了完整功能的TCA循環(huán)來避免高濃度乙醇的積累，又過表達一份FFAs合成途徑來競爭碳源和消耗過多的NADH，得到菌株SynENG058，發(fā)酵后使用Dodecane進行提取，得到20 g/L的FFAs，產(chǎn)率達到0.134 g FFAs/g葡萄糖，為最高理論得率的40%（圖5f）。
圖5.合成能量系統(tǒng)提高FFAs生產(chǎn)。a. 雙能量引擎供給FFAs生產(chǎn)示意圖。b. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持細(xì)胞生長。c. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持FFAs生產(chǎn)。d. 果糖-1,6-二磷酸酶過表達提高了FFAs的生產(chǎn)。e. NOG途徑與合成能量系統(tǒng)協(xié)作提高了FFAs的生產(chǎn)。f. 限糖限氮條件下SynENG058菌株的補料分批發(fā)酵。
生物技術(shù)的挑戰(zhàn)之一是如何在剛性代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上改變胞內(nèi)能量（ATP）和還原力（NADH/NADPH）的相對化學(xué)計量比，來積累過量能量/還原力進行產(chǎn)品合成。本文構(gòu)建了一個合成能量系統(tǒng)為細(xì)胞供給額外的能量和還原力，經(jīng)過實驗驗證，該系統(tǒng)可替代原有的TCA循環(huán)，可支持高還原度化學(xué)品的生產(chǎn)，也可與其他途徑合作高效生產(chǎn)以乙酰輔酶A為前體的化學(xué)品。這是第一個通過理性設(shè)計構(gòu)建的合成能量系統(tǒng)，這項研究揭示了細(xì)胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)的可塑性：盡管經(jīng)過了幾百萬年的進化，細(xì)胞的能量代謝網(wǎng)絡(luò)依然可以重構(gòu)。
該研究工作獲得國家重點研發(fā)計劃（2020YFA0907800，2021YFA0911000）、國自然面上基金（NSFC 32071416）、深圳合成院交叉項目（JCHZ20200003）、深圳市微生物藥物智能制造重點實驗室以及深圳市合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。
參考文獻：
[1] Zhang, Y. et al. Adaptive mutations in sugar metabolism restore growth on glucose in a pyruvate decarboxylase negative yeast strain. Microb Cell Fact 14, 116, doi:10.1186/s12934-015-0305-6 (2015).
[2] Yu, T. et al. Reprogramming Yeast Metabolism from Alcoholic Fermentation to Lipogenesis. Cell 174, 1549-1558 e1514, doi:10.1016/j.cell.2018.07.013 (2018）.
標(biāo)簽： 合成能量系統(tǒng)
