在真核細(xì)胞中，RNA可以“形單影只”，也可以與蛋白質(zhì)“珠聯(lián)璧合”。后者被稱為RNA結(jié)合蛋白，擁有強(qiáng)大的基因調(diào)節(jié)能力。但RNA究竟與哪些蛋白結(jié)合，將怎樣作用于人類的發(fā)育、疾病?這都是懸而未決的問(wèn)題。
6月10日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員薛愿超團(tuán)隊(duì)與合作者開發(fā)了可在微量細(xì)胞中鑒定RNA結(jié)合蛋白作用靶點(diǎn)的新技術(shù)LACE-seq，首次實(shí)現(xiàn)了在單堿基分辨率和單細(xì)胞層面精準(zhǔn)鑒定RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，為研究RNA結(jié)合蛋白在胚胎發(fā)育和生殖疾病中的功能機(jī)制打開了大門。相關(guān)成果發(fā)表于《自然—細(xì)胞生物》。
尋覓工具
人類基因組共編碼了約1500個(gè)RNA結(jié)合蛋白，它們往往通過(guò)結(jié)合RNA分子上的特定基序或結(jié)構(gòu)元件而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩(wěn)定性等。
研究表明，RNA結(jié)合蛋白在早期生殖、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過(guò)程中都發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。同時(shí)，RNA結(jié)合蛋白的突變會(huì)導(dǎo)致多種遺傳性疾病，比如肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、骨髓增生異常綜合征等。
因此，準(zhǔn)確鑒定RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合靶標(biāo)及精確結(jié)合位置是理解其生理和病理調(diào)控機(jī)制的前提。
薛愿超介紹，目前常用的鑒定RNA結(jié)合蛋白靶標(biāo)的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq。由于這兩種方法都依賴于利用特異性抗體富集RNA結(jié)合蛋白及其所結(jié)合的RNA，而且需要百萬(wàn)數(shù)量級(jí)的細(xì)胞，嚴(yán)重限制了其在稀有細(xì)胞類型及臨床穿刺樣本中的應(yīng)用。
比如，由于缺乏可在微量細(xì)胞甚至單細(xì)胞水平研究RNA結(jié)合蛋白靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法，導(dǎo)致人們?nèi)圆磺宄缙谏尺^(guò)程中RNA結(jié)合蛋白及其復(fù)合物的分子機(jī)制。
“當(dāng)前針對(duì)RNA結(jié)合蛋白的相關(guān)技術(shù)研究多是在干細(xì)胞和體細(xì)胞等可以在體外大量擴(kuò)增的細(xì)胞系中進(jìn)行，而在早期生殖和臨床穿刺等微量樣本中的研究依然是個(gè)空白。”薛愿超告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》。
推開大門
曾經(jīng)在華大基因從事兩年RNA相關(guān)技術(shù)研發(fā)的蘇瑞寶加入薛愿超團(tuán)隊(duì)，成為薛愿超的第二位博士生，為團(tuán)隊(duì)開發(fā)LACE-seq方法奠定了基礎(chǔ)。
為了建立這個(gè)方法，蘇瑞寶認(rèn)真細(xì)致地優(yōu)化了每一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件。在LACE-seq方法搭建完成之后，團(tuán)隊(duì)重點(diǎn)研究了RNA結(jié)合蛋白Ago2/endo-siRNA沉默復(fù)合物在小鼠MII時(shí)期卵細(xì)胞中的作用靶標(biāo)，解析了Ago2/endo-siRNA復(fù)合體在卵細(xì)胞中調(diào)控mRNA翻譯以及抑制轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的嵌合體轉(zhuǎn)錄本生成等一系列新機(jī)制和新規(guī)律。
在應(yīng)用上，團(tuán)隊(duì)利用創(chuàng)建的LACE-seq方法，首次在卵細(xì)胞中繪制了Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RNA結(jié)合蛋白的具體靶標(biāo)和結(jié)合位置，率先發(fā)現(xiàn)Ago2/endo-siRNA沉默復(fù)合物在卵細(xì)胞中以非完全互補(bǔ)配對(duì)的方式抑制mRNA的翻譯，并證明endo-siRNA的靶標(biāo)Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質(zhì)水平變化可能與Ago2敲除后的表型相關(guān)。
此外，他們還證明了Ago2/endo-siRNA復(fù)合物可切割由逆轉(zhuǎn)座子啟動(dòng)子起始的嵌合體RNA，該機(jī)制確保了卵細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的完整性。
LACE-seq技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間短、信噪比高、有效數(shù)據(jù)多、成本更加低廉等一系列優(yōu)勢(shì)，克服了現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法的缺點(diǎn)，有效解決了該領(lǐng)域的難題。這些優(yōu)勢(shì)使得在珍稀的微量細(xì)胞如早期生殖細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、臨床穿刺樣本中，研究RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控、致病機(jī)理成為了可能。
LACE-seq技術(shù)通過(guò)線性擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)處的終止信號(hào)，首次實(shí)現(xiàn)了在單堿基分辨率和單細(xì)胞層面精準(zhǔn)鑒定RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
可以說(shuō)，LACE-seq技術(shù)為研究RNA結(jié)合蛋白及其復(fù)合物在早期生殖、胚胎發(fā)育等過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)的新規(guī)律打開了大門。
建立圖譜
RNA結(jié)合蛋白，英文簡(jiǎn)稱RBP。據(jù)相關(guān)研究，大約5%~10%的人類蛋白質(zhì)可以與RNA結(jié)合。但到目前為止，研究人員尚未對(duì)所有RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行普查，已知的RBP數(shù)量仍然是估計(jì)數(shù)。
RBP關(guān)系人類基因奧秘，功能重要。建立起RBP“家族”圖譜，才能更有助于挖掘一個(gè)個(gè)“金礦”。
美國(guó)于2013年啟動(dòng)了一項(xiàng)大型研究計(jì)劃，準(zhǔn)備利用增強(qiáng)型的紫外交聯(lián)和免疫共沉淀方法eCLIP來(lái)系統(tǒng)解碼RBP的調(diào)控機(jī)制，目前已經(jīng)成功繪制了150個(gè)RBP的結(jié)合圖譜。不過(guò)，我國(guó)迄今還沒(méi)有相關(guān)的RBP圖譜研究計(jì)劃。
“接下來(lái)，我們將與國(guó)內(nèi)同行合作，希望快速推動(dòng)LACE-seq方法的應(yīng)用，尤其是在生殖及相關(guān)疾病中的研究。同時(shí)我們希望建立全自動(dòng)化LACE-seq平臺(tái)，以大規(guī)模注釋RBP的功能機(jī)制，并發(fā)起有中國(guó)特色的RBP圖譜計(jì)劃。”薛愿超說(shuō)。
