圖為一個盛開著罌粟花的大腦，罌粟是阿片類鎮(zhèn)痛藥的重要來源。罌粟花上有一只青蛙，表示本研究中使用了來自青蛙皮膚表面的皮啡肽。圖像右側(cè)是四個被激活的阿片受體的結(jié)構(gòu)被嵌在細胞膜內(nèi)。來自罌粟中的阿片物質(zhì)模擬了人體內(nèi)的阿片肽功能，均通過結(jié)合阿片受體來調(diào)控人體內(nèi)鎮(zhèn)痛、感知、獎賞等生理活動。本研究報道了整個阿片受體家族結(jié)合內(nèi)源性多肽，以及DOR和青蛙皮膚表面的外源皮啡肽的三維結(jié)構(gòu)。
(相關(guān)資料圖)
內(nèi)源阿片系統(tǒng)由四個阿片受體成員以及一系列阿片肽組成，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中，調(diào)控鎮(zhèn)痛、欣快、獎賞、認知、應(yīng)激等信號通路，是臨床用于治療疼痛、焦慮等疾病的重要靶標(biāo)。
阿片受體家族共有四個成員，分別為μOR、δOR、κOR、NOPR，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要通過偶聯(lián)下游Gi蛋白發(fā)揮功能。阿片受體不僅會被體內(nèi)產(chǎn)生的阿片肽激活，也會被外源的阿片類/非阿片類藥物激活，包括廣為人知的嗎啡、芬太尼等藥物。在2022年11月10號的Cell期刊上，徐華強研究員/莊友文副研究員團隊聯(lián)合謝欣研究員團隊、王明偉教授團隊，首次報道了嗎啡和芬太尼結(jié)合人源μOR-Gi蛋白信號復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，揭示了兩者在結(jié)合μ型阿片受體上的關(guān)鍵差異因素。
靶向μOR的小分子阿片藥物廣泛用于臨床中至重度的急性疼痛，然而它們在強效鎮(zhèn)痛的同時也伴隨著耐藥、呼吸抑制、成癮等諸多嚴(yán)重的副作用。為了開發(fā)更低毒副作用的鎮(zhèn)痛類藥物，科研人員將目光聚焦到了其它亞型阿片受體的激動劑上，成功促進了一些鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)，包括靶向κOR的地佐辛、鹽酸噴他佐辛酯、納布啡癸二酸，氫溴酸依他佐辛等上市藥物，靶向δOR的SRI-22138、BMS986187等臨床在研藥物，靶向NOPR的PPL-138、LY-2940094等臨床在研藥物（源于藥渡數(shù)據(jù)）。盡管有了很大的進展，由于小分子藥物較差的選擇性和藥理活性，還是引發(fā)了其他副作用：致幻、驚厥、癲癇等，導(dǎo)致它們的臨床進展受到了阻礙、甚至被終止。
人體中的阿片肽不僅是強效鎮(zhèn)痛藥嗎啡等外源阿片藥物的天然模板，而且在機體自身分泌的濃度下不導(dǎo)致成癮、呼吸抑制等副作用，內(nèi)源性的阿片肽對四種阿片受體具有很高的親和力以及激動活性，最重要的是具有高度選擇性，這些特性賦予了它們重要的研發(fā)價值。近幾年隨著那句“少年只知多巴胺，中年才懂內(nèi)啡肽”網(wǎng)絡(luò)名言的廣為流傳，刺激內(nèi)啡肽生成的勵志活動被逐漸推廣。內(nèi)啡肽是阿片肽眾多成員中的一種多肽神經(jīng)遞質(zhì)，它會在身體感到疼痛或者有壓力時被釋放，有助于減輕疼痛、緩解壓力，內(nèi)啡肽也會在按摩、跑步、游泳等鍛煉運動中被釋放，通過機體的獎賞信號通路來提升人的幸福感。阿片肽由一系列前體蛋白經(jīng)過酶解和修飾得到，包括內(nèi)啡肽、強啡肽、腦啡肽和痛敏肽等。除了內(nèi)源性的阿片肽以外，阿片受體也會被外源的多肽激活，包括食物中的酪啡肽、青蛙皮膚表面的皮啡肽等。
隨著X-射線晶體技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，在近20年間，已經(jīng)有超過800個GPCR相關(guān)的結(jié)構(gòu)被報道（源于GPCRdb），阿片受體作為舉足輕重的一類藥物靶標(biāo)，該家族的失活和激活結(jié)構(gòu)也被相繼發(fā)表，在之前的研究中，很多備受關(guān)注的科學(xué)問題得以解釋，包括阿片受體與小分子拮抗劑/激動劑的結(jié)合模式，鈉離子口袋介導(dǎo)的激活機制，μOR的偏向性機制等。然而，內(nèi)源性阿片肽配體如何選擇性識別并激活不同亞型阿片受體的分子機制尚不清楚，阻礙了科研人員對阿片肽的認知與合理的設(shè)計改造。
2023年1月12日，中國科學(xué)院上海藥物研究所徐華強/莊友文團隊聯(lián)合美國北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校Bryan L. Roth團隊合作在國際頂級期刊Cell上以長文形式在線發(fā)表了題為“Structures of the entire human opioid receptor family”的研究論文。該項研究系統(tǒng)地分析和明確了各內(nèi)源性阿片肽對阿片受體的信號活性，并進一步解析了阿片受體家族四個亞型μOR、δOR、κOR、NOPR和各自的選擇性阿片肽包括內(nèi)啡肽、內(nèi)嗎啡肽、強啡肽、皮啡肽和痛敏肽的冷凍電鏡復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合大量細胞水平的功能實驗，揭示了多肽類配體和阿片受體的結(jié)合模式，闡述了它們的選擇性和保守性機制，為“信使-信箱-效能”模式提供了結(jié)構(gòu)和功能支持。
在本項研究中，研究人員首先通過細胞水平的功能實驗，較為系統(tǒng)地分析了阿片肽對野生型阿片受體的的信號傳導(dǎo)特性。由于內(nèi)啡肽和腦啡肽對μOR、δOR的激活程度相近，為了系統(tǒng)地闡述選擇性差異，研究人員最終鎖定了內(nèi)啡肽以及選擇性更顯著的內(nèi)嗎啡肽、強啡肽、痛敏肽和外源的皮啡肽作為研究對象，分別解析了內(nèi)啡肽-μOR、內(nèi)嗎啡肽-μOR、強啡肽-κOR、痛敏肽-NOPR，皮啡肽-δOR的高分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)，并用第二信使cAMP的抑制試驗、G蛋白和arrestin蛋白的招募實驗來分析突變體的特性。
圖1. 阿片受體結(jié)合阿片肽的功能實驗和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。A：阿片肽誘導(dǎo)阿片受體激活的親和力，B：cAMP抑制曲線結(jié)果，C：Gi招募實驗的曲線結(jié)果，D-H：阿片受體結(jié)合阿片肽的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和原子模型。
研究發(fā)現(xiàn)，所有的阿片肽都是以N端插入的方式進入受體，阿片肽的N端基序YGGF（痛敏肽是FGGF）“信使”結(jié)合在阿片受體極為保守的正構(gòu)結(jié)合口袋腔室里，第一個酪氨酸/苯丙氨酸主鏈上的胺基均與D3.32Q2.60Y7.43基序形成極性網(wǎng)絡(luò)，該保守腔室對配體的識別和藥理活性是必不可少的，合成的YGGF四肽便可以通過較弱的作用激活四個受體（EC50約10μM）。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，阿片受體的胞外端，主要為ECL2/3以及TM2/6/7的胞外端在序列和帶電性上都具有差異性，比如κOR和NOPR的ECL2富含帶負電的氨基酸，對應(yīng)的強啡肽和痛敏肽在ECL2處富含帶正電的氨基酸。大規(guī)模功能突變實驗結(jié)果表明，阿片受體ECL2/3和TM2/6/7的胞外端序列不保守性和帶電差異性共同決定著阿片受體對阿片肽的選擇性結(jié)合。
NOPR是阿片受體家族中最后一個被發(fā)現(xiàn)的受體，沒有被冠以希臘字母名稱，本研究解析的痛敏肽結(jié)合NOPR的結(jié)構(gòu)，也是首個激活形式NOPR的結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)比對分析，不出意外地發(fā)現(xiàn)它遵循阿片受體通用的激活機制。除此之外，阿片受體對于下游Gi蛋白有著極高的選擇性，本研究發(fā)現(xiàn)阿片受體的ICL3會形成一個短的α螺旋與Gi形成疏水作用，同時保守的精氨酸與Gi形成靜電作用。這也可以部分解釋Gi結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)都含有完整的ICL3，而與其他亞型G蛋白（Gs，Gq）結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)中往往缺失了ICL3的電子云密度的原因。
綜上所述，研究團隊通過解析阿片肽結(jié)合的阿片受體結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)地闡釋了多肽配體的結(jié)合模式，揭示了阿片受體中保守的結(jié)合口袋以及獨特的ECL2/3共同介導(dǎo)阿片肽的作用機制，闡明了阿片受體通用的激活機制以及對下游Gi蛋白的選擇性特征。這些工作為理解阿片系統(tǒng)的生物學(xué)特性提供了夯實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為設(shè)計新型高效的阿片肽類鎮(zhèn)痛藥物鋪平了道路。
圖2. 阿片受體和阿片肽的選擇以及“信使-信箱”概念的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
本研究冷凍電鏡數(shù)據(jù)在上海藥物所高峰電鏡中心和上海藥物所冷凍電鏡平臺收集。中國科學(xué)院上海藥物所博士研究生王悅、副研究員莊友文、北卡羅來納大學(xué)教堂山分校Jeffery F. DiBerto為該論文的共同第一作者。上海藥物所徐華強研究員、莊友文副研究員，以及北卡羅來納大學(xué)教堂山分校Bryan L. Roth教授為論文的共同通訊作者。參與本次研究的還有上海藥物所碩士畢業(yè)生劉衛(wèi)一、高峰電鏡中心執(zhí)行主任袁青寧，美國溫安洛研究所Karsten Melcher教授和X. Edward Zhou博士等。該工作獲得了國家自然科學(xué)基金委、科技部重點研發(fā)計劃、上海市科技重大專項、中科院特別助理研究項目以及美國國立心理健康研究院、國立衛(wèi)生研究院等的項目經(jīng)費資助。
全文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.026
標(biāo)簽： 阿片受體
