“基因剪刀”微生物免疫“分子警察”

自2012年6月CRISPR-Cas9技術(shù)誕生以來，這項(xiàng)被稱為“基因剪刀”的革命性技術(shù)已應(yīng)用于植物育種、癌癥治療等多個(gè)領(lǐng)域，成為全球?qū)嶒?yàn)室里最風(fēng)靡的基因編輯技術(shù)。它還斬獲了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

“CRISPR-Cas系統(tǒng)是微生物中廣泛存在的抗病毒免疫系統(tǒng)——約90%的古菌和40%的細(xì)菌基因組中都存在這一系統(tǒng)。”中國科學(xué)院微生物研究所(以下簡稱微生物所)研究員向華在接受《中國科學(xué)報(bào)》采訪時(shí)說。那么，這一系統(tǒng)是如何在微生物中廣泛存在并發(fā)揮作用的?是否有一些“暗物質(zhì)”在維持這一系統(tǒng)的穩(wěn)定性?

經(jīng)過近7年的研究，向華與微生物所研究員李明及合作者找到了保護(hù)微生物CRISPR-Cas系統(tǒng)的“暗物質(zhì)”。相關(guān)研究論文近日發(fā)表于《科學(xué)》。

微生物免疫“分子警察”

“實(shí)際上，‘基因剪刀’這一革命性的生物技術(shù)起源于科學(xué)家對(duì)微生物中一種特殊的免疫系統(tǒng)的研究，即CRISPR-Cas。”該論文共同第一作者兼通訊作者李明對(duì)《中國科學(xué)報(bào)》說。

據(jù)介紹，CRISPR-Cas系統(tǒng)是在微生物中廣泛存在的抗病毒(噬菌體)免疫系統(tǒng)。宿主菌通過將入侵病毒的特定DNA序列插入到其CRISPR結(jié)構(gòu)中，可形成對(duì)該病毒的永久性“記憶”。這些記憶性DNA序列可經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)生小分子RNA。它們攜帶了病毒的序列信息，能夠指導(dǎo)CRISPR效應(yīng)蛋白(如Cas9蛋白、Cascade蛋白復(fù)合物)特異性識(shí)別和切割再次入侵的病毒DNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)該病毒的適應(yīng)性免疫。

“如果將CRISPR結(jié)構(gòu)比作記錄了病毒DNA這種‘犯罪分子’信息的檔案庫，那么CRISPR效應(yīng)蛋白就像一些‘分子警察’，手持寫有病毒序列特征的批捕文件(crRNA)，在細(xì)胞內(nèi)尋找并消滅‘犯罪分子’(病毒DNA)。”李明解釋說。

對(duì)此，向華表示，CRISPR-Cas系統(tǒng)的維持和表達(dá)往往消耗大量的物質(zhì)和能量，給宿主細(xì)胞造成一定的負(fù)擔(dān)，同時(shí)它也有發(fā)生“自免疫”的風(fēng)險(xiǎn)，即殺死宿主細(xì)胞。因此，在進(jìn)化過程中，細(xì)菌可能會(huì)丟棄這個(gè)系統(tǒng)。

那么，是什么導(dǎo)致CRISPR-Cas系統(tǒng)在微生物中具有廣泛的穩(wěn)定性呢?這是微生物學(xué)家長期關(guān)注卻尚未充分回答的前沿科學(xué)問題。

經(jīng)過反復(fù)的猜測(cè)和試錯(cuò)驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，“保護(hù)”微生物CRISPR-Cas系統(tǒng)的“暗物質(zhì)”是一對(duì)RNA分子。

“自私”的護(hù)衛(wèi)

向華和李明團(tuán)隊(duì)是國內(nèi)較早從事CRISPR免疫機(jī)制研究的團(tuán)隊(duì)。早在2014年，他們利用一株名為西班牙鹽盒菌的古菌及其病毒，系統(tǒng)解析了CRISPR高效獲取病毒DNA序列信息的分子機(jī)制。

研究過程中，他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)奇怪的現(xiàn)象——CRISPR效應(yīng)蛋白的編碼基因(Cas5/6/7/8)無法逐一敲除，但可以作為整體一起敲除，從而推測(cè)“分子警察”Cas的基因簇中可能隱藏了一個(gè)“細(xì)胞成癮”元件。“也就是說，有一些‘暗物質(zhì)’讓細(xì)胞對(duì)CRISPR-Cas蛋白上癮，沒有這些蛋白，宿主細(xì)胞就會(huì)‘癮發(fā)身亡’。”李明解釋說。

為查明“暗物質(zhì)”的身份，他們經(jīng)過近7年的探索，在Cas的基因簇附近發(fā)現(xiàn)了一類由兩個(gè)小RNA組成的全新的毒素—抗毒素系統(tǒng)，并將兩個(gè)小RNA分別命名為毒素(CreT)和抗毒素(CreA)。他們發(fā)現(xiàn)這一對(duì)神秘小RNA通過一系列十分精巧的分子機(jī)制守護(hù)了CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。

“我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)毒素—抗毒素系統(tǒng)與CRISPR-Cas偶聯(lián)存在時(shí)，Cas效應(yīng)蛋白可以和抗毒素共同抑制毒素的表達(dá)，而一旦Cas效應(yīng)蛋白被破壞，就會(huì)釋放毒素并殺死細(xì)胞。”李明說。

他進(jìn)一步解釋，這說明CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)蛋白在細(xì)胞中具有雙重生理功能。它們一部分扮演著“分子警察”的角色，攜帶寫有病毒序列信息的批捕文件，尋找入侵的病毒DNA并將其消滅;而另一部分效應(yīng)蛋白則手持“抗毒素”控制器，守護(hù)在定時(shí)炸彈“毒素”基因旁邊，一旦CRISPR-Cas系統(tǒng)丟失或被病毒破壞，它們就引爆炸彈，炸毀細(xì)胞中關(guān)鍵的蛋白質(zhì)合成機(jī)器，使細(xì)胞休眠甚至死亡。

“CRISPR系統(tǒng)的這種貌似‘自私’的特性，使我們能夠從更高維度上認(rèn)識(shí)微生物的免疫策略。”向華補(bǔ)充說。在自然界中，微生物往往以群體的形式存在，當(dāng)某個(gè)細(xì)胞的CRISPR系統(tǒng)被病毒破壞時(shí)，很容易淪為病毒大量復(fù)制和增殖的病毒工廠，可以產(chǎn)生成百上千的子代病毒侵染群體中的其他細(xì)胞。而當(dāng)CRISPR內(nèi)置了毒素—抗毒素RNA系統(tǒng)，一旦CRISPR效應(yīng)物被病毒破壞，它就會(huì)毀掉病毒復(fù)制和增殖所必需的細(xì)胞機(jī)器，從而保護(hù)群體中其他細(xì)胞不被侵染，因此，這是一種利他主義的群體防御策略。

“這項(xiàng)研究中描述的發(fā)現(xiàn)無疑是新奇而有趣的。”一位審稿人在評(píng)議時(shí)表示。其他審稿人也認(rèn)為，“這絕對(duì)是一項(xiàng)好研究”“代表了一個(gè)令人興奮的發(fā)現(xiàn)和令人信服的想法”。

打開了解RNA“暗物質(zhì)”新窗口

據(jù)該論文共同第一作者、微生物所博士后龔路遙介紹，此前，科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)6類毒素—抗毒素分子對(duì)，其中毒素均為蛋白質(zhì)。這是研究人員首次在RNA層面發(fā)現(xiàn)毒素和抗毒素分子對(duì)。

“由于缺乏保守的序列特征，非編碼RNA的預(yù)測(cè)和功能研究是非常困難的。但實(shí)際上越來越多證據(jù)表明，非編碼RNA在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮了非常重要的作用。”龔路遙說，這些RNA被稱為基因組中的“暗物質(zhì)”。

該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，在不同古菌、細(xì)菌不同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)中，存在的毒素—抗毒素類似物在序列上非常豐富多樣，蘊(yùn)藏了大量未知機(jī)制的功能性小RNA。“這將為原核微生物‘非編碼RNA暗物質(zhì)世界’的研究打開一扇寶貴的窗口。對(duì)這些豐富多樣的‘暗物質(zhì)’的深入發(fā)掘?qū)⑦M(jìn)一步推動(dòng)生物技術(shù)的發(fā)展，例如對(duì)于小RNA腫瘤藥物、新型抗生素的研制等，或?qū)⒕哂兄匾膯l(fā)意義。”向華說。

“這是一項(xiàng)十分優(yōu)秀的研究，即使在CRISPR領(lǐng)域之外也很重要，有助于我們理解病毒防御和基因調(diào)控的共進(jìn)化這一重要命題。”美國國立衛(wèi)生研究院生物技術(shù)信息中心教授Eugene Koonin說。

標(biāo)簽： “基因剪刀”