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| 更高效、廣適、精準(zhǔn) |
| 基因編輯2.0升級版賦予更強(qiáng)個性化修改能力 |
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近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（以下簡稱遺傳發(fā)育所）高彩霞研究組與合作者，在植物中成功建立了一種更高效、廣適的新型基因組引導(dǎo)編輯系統(tǒng)——增強(qiáng)型植物引導(dǎo)編輯器（ePPE），有助進(jìn)一步提高基因組編輯技術(shù)在內(nèi)源基因上進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的效率。研究人員還利用該系統(tǒng)創(chuàng)制了抗除草劑的水稻新材料。相關(guān)結(jié)果3月24日在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。
“這項工作論證充分且十分有趣。”一位審稿人寫道，“引導(dǎo)編輯提供了對基因組進(jìn)行定制化更改的能力，克服了堿基編輯器有限的替代能力。作者描述的引導(dǎo)編輯器可在植物基因組上將引導(dǎo)編輯效率提高數(shù)倍。”
“2.0時代”的引導(dǎo)編輯
在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，基因組編輯技術(shù)可以更方便、快捷、精準(zhǔn)地進(jìn)行作物育種和改良。通過基因組編輯可以不添加任何外源性的基因，實現(xiàn)對基因組自身序列的修改，大大節(jié)省了時間和工作量。
事實上，基因組編輯技術(shù)從2012年誕生至今，經(jīng)過10年的發(fā)展已經(jīng)不僅僅是“一把剪刀”的概念。論文通訊作者、遺傳發(fā)育所研究員高彩霞在接受《中國科學(xué)報》采訪時介紹，進(jìn)化至“2.0時代”的堿基編輯和引導(dǎo)編輯還可以是一塊“橡皮”或一支“鉛筆”。
“如果一個序列有點多，你可以把它剪掉；如果組成DNA的四個字母ATCG有一個錯了，你可以像用一個‘橡皮擦’把它擦掉，然后用‘鉛筆’寫入正確字母，而‘鉛筆’、‘橡皮擦’是不留在細(xì)胞里的。”她比喻說。
更具體地說，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（PE）是一種能夠在基因組的靶位點處實現(xiàn)任意堿基替換和小片段精準(zhǔn)刪除、插入的新型基因組編輯工具，也是基因組編輯領(lǐng)域的重大變革。
2020年，高彩霞團(tuán)隊率先在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導(dǎo)編輯器（PPE），開發(fā)了植物引導(dǎo)編輯向?qū)NA（pegRNA）設(shè)計網(wǎng)站——PlantPegDesigner，極大提高了引導(dǎo)編輯效率并簡化了植物pegRNA的設(shè)計流程。他們還通過全基因組重測序發(fā)現(xiàn)PPE系統(tǒng)在全基因組水平上具有很高的特異性。這些研究為引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在植物領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
盡管如此，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)目前在植物中的編輯效率仍不夠高，且有很大的靶點依賴性。“也就是說在一些內(nèi)源靶位點上，現(xiàn)有的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)效率仍然很低，尤其是針對一些較長片段的刪除、插入這種復(fù)雜的編輯類型。”論文第一作者、高彩霞課題組博士生劉怡靜向《中國科學(xué)報》解釋。
這些短板嚴(yán)重限制了引導(dǎo)編輯在植物中的廣泛應(yīng)用。因此，如何優(yōu)化引導(dǎo)編輯系統(tǒng)突破現(xiàn)有的限制，提升引導(dǎo)編輯技術(shù)的高效性、廣適性是一個研究重點。
尋找更高效“突破點”
萬事開頭難。如何去優(yōu)化引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)更高效、廣適的編輯呢？這是合作團(tuán)隊一直思考的問題。為此，他們先后構(gòu)思嘗試了多種不同策略，最終通過對蛋白的理性設(shè)計獲得了能夠穩(wěn)定提高效率的ePPE的版本。
不同于大多數(shù)已報道的通過優(yōu)化pegRNA提高引導(dǎo)編輯效率的思路，新型引導(dǎo)編輯系統(tǒng)ePPE側(cè)重于對引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的蛋白組分進(jìn)行改造。通過對不同策略構(gòu)建的多種引導(dǎo)編輯系統(tǒng)進(jìn)行篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)刪除引導(dǎo)編輯系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT（依賴RNA的DNA聚合酶）的RNA核酸酶H（RNase H）結(jié)構(gòu)域或在M-MLV RT 的N端融合病毒核衣殼蛋白（NC），可分別將PPE的編輯效率提高2.0倍和3.2倍。
究其原因，他們推測，RNase H結(jié)構(gòu)域的去除穩(wěn)定了sgRNA-DNA和nCas9-RT-pegRNA復(fù)合體中的RNA-DNA異源雙鏈結(jié)構(gòu)，NC蛋白通過其核酸退火活性在逆轉(zhuǎn)錄過程中輔助MLV-RT發(fā)揮功能。
研究人員進(jìn)一步地通過整合以上兩種優(yōu)化策略，開發(fā)出了升級版新型引導(dǎo)編輯器ePPE。相比于PPE，ePPE在堿基替換、小片段插入、刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下編輯效率平均可提高5.8倍，且不增加脫靶及副產(chǎn)物的發(fā)生。
“ePPE作為一個更高效、廣適的引導(dǎo)編輯器，可以算作是一支流暢合格的‘鉛筆’，一塊干凈好用的‘橡皮’了。”劉怡靜表示。
對此，另一位審稿人也表示：“這項研究在植物基因組編輯領(lǐng)域做出了及時而重要的貢獻(xiàn)。”
種質(zhì)創(chuàng)新“小試牛刀”
除了高效和廣適性，合作團(tuán)隊通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把新型引導(dǎo)編輯器ePPE與該課題組此前報道的dual-pegRNA策略和哈佛大學(xué)、博德研究所教授劉如謙實驗室研發(fā)的epegRNA策略相結(jié)合時，可進(jìn)一步提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在內(nèi)源基因上進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的效率。
這些特性在很大程度上拓展了其應(yīng)用范圍?；诖?，研究人員利用ePPE系統(tǒng)成功創(chuàng)制了對兩種除草劑（甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆）具備抗性的水稻新材料。
劉怡靜介紹，乙酰乳酸核酶（OsALS）基因是支鏈氨基酸合成途徑中的第一個酶，諸如磺酰脲類、咪唑啉酮、三唑嘧啶等除草劑都是該酶的抑制劑，通過抑制支鏈氨基酸的合成導(dǎo)致植物死亡，從而除去很多雜草。同時，這類除草劑對哺乳動物毒性非常小，應(yīng)用價值很高。
“通過在ALS基因的特定位置上產(chǎn)生單個氨基酸的突變，可以獲得抗性酶，賦予植物這一類除草劑抗性。”她表示，研究團(tuán)隊選擇了Trp548Met突變作為目標(biāo)靶點，該位點突變雖然可通過傳統(tǒng)誘變的方法獲得，但耗時耗力，需要巨大的工作量。而使用基因編輯方法不存在像誘變產(chǎn)生的其他有害突變，沒有脫靶，也無需回交，突變體植株可快速投入應(yīng)用生產(chǎn)。
研究人員在這一位點將編碼色氨酸的“TGG”密碼子修改為編碼甲硫氨酸的密碼子“ATG”，通過“鉛筆”+“橡皮擦”，同時實現(xiàn)“T到A”和“G到T”的突變。據(jù)介紹，這是目前引導(dǎo)編輯外的其他編輯工具所不能實現(xiàn)的。最終他們以高出原始引導(dǎo)編輯器PPE 5.6倍的效率成功獲得了抗除草劑的水稻新材料，并且在甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆兩種除草劑的篩選下有非常好的抗性表型。
“我國雖然在動植物基因編輯技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用上居于世界前列，但原始專利嚴(yán)重缺位，核心專利及底層技術(shù)大多被美國為首的西方國家壟斷，產(chǎn)業(yè)安全面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)，加快推動基因組編輯基礎(chǔ)研究是國家發(fā)展和戰(zhàn)略布局的迫切需求。”論文共同通訊作者、遺傳發(fā)育所研究員曹曉風(fēng)院士在接受《中國科學(xué)報》采訪時曾說。
而新系統(tǒng)的開發(fā)有望推動引導(dǎo)編輯在農(nóng)業(yè)育種、作物改良等方面的應(yīng)用。“我們也期待有更加流暢的‘彩筆’不僅可以實現(xiàn)更長片段的精準(zhǔn)改寫，也可以精致的繪制改寫基因組上的修飾，畫出‘彩色’的基因組信息。”劉怡靜說。
植物高效新型引導(dǎo)編輯器ePPE的建立及應(yīng)用。a-b，原生質(zhì)體報告系統(tǒng)篩選候選植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)。c，基于刪除RNase H結(jié)構(gòu)域和融合NC蛋白兩種策略構(gòu)建的引導(dǎo)編輯器與PPE編輯效率對比。d, ePPE示意圖。e，四種不同引導(dǎo)編輯器編輯效率對比。f，ePPE與已報道pegRNA優(yōu)化策略結(jié)合的編輯效率對比。g，ALS-W548M水稻突變體在不同除草劑處理下的表型。作者供圖
相關(guān)論文信息：
https://doi.org/10.1038/s41587-022-01254-w
近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（以下簡稱遺傳發(fā)育所）高彩霞研究組與合作者，在植物中成功建立了一種更高效、廣適的新型基因組引導(dǎo)編輯系統(tǒng)——增強(qiáng)型植物引導(dǎo)編輯器（ePPE），有助進(jìn)一步提高基因組編輯技術(shù)在內(nèi)源基因上進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的效率。研究人員還利用該系統(tǒng)創(chuàng)制了抗除草劑的水稻新材料。相關(guān)結(jié)果3月24日在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。
“這項工作論證充分且十分有趣。”一位審稿人寫道，“引導(dǎo)編輯提供了對基因組進(jìn)行定制化更改的能力，克服了堿基編輯器有限的替代能力。作者描述的引導(dǎo)編輯器可在植物基因組上將引導(dǎo)編輯效率提高數(shù)倍。”
“2.0時代”的引導(dǎo)編輯
在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，基因組編輯技術(shù)可以更方便、快捷、精準(zhǔn)地進(jìn)行作物育種和改良。通過基因組編輯可以不添加任何外源性的基因，實現(xiàn)對基因組自身序列的修改，大大節(jié)省了時間和工作量。
事實上，基因組編輯技術(shù)從2012年誕生至今，經(jīng)過10年的發(fā)展已經(jīng)不僅僅是“一把剪刀”的概念。論文通訊作者、遺傳發(fā)育所研究員高彩霞在接受《中國科學(xué)報》采訪時介紹，進(jìn)化至“2.0時代”的堿基編輯和引導(dǎo)編輯還可以是一塊“橡皮”或一支“鉛筆”。
“如果一個序列有點多，你可以把它剪掉；如果組成DNA的四個字母ATCG有一個錯了，你可以像用一個‘橡皮擦’把它擦掉，然后用‘鉛筆’寫入正確字母，而‘鉛筆’、‘橡皮擦’是不留在細(xì)胞里的。”她比喻說。
更具體地說，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（PE）是一種能夠在基因組的靶位點處實現(xiàn)任意堿基替換和小片段精準(zhǔn)刪除、插入的新型基因組編輯工具，也是基因組編輯領(lǐng)域的重大變革。
2020年，高彩霞團(tuán)隊率先在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導(dǎo)編輯器（PPE），開發(fā)了植物引導(dǎo)編輯向?qū)NA（pegRNA）設(shè)計網(wǎng)站——PlantPegDesigner，極大提高了引導(dǎo)編輯效率并簡化了植物pegRNA的設(shè)計流程。他們還通過全基因組重測序發(fā)現(xiàn)PPE系統(tǒng)在全基因組水平上具有很高的特異性。這些研究為引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在植物領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
盡管如此，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)目前在植物中的編輯效率仍不夠高，且有很大的靶點依賴性。“也就是說在一些內(nèi)源靶位點上，現(xiàn)有的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)效率仍然很低，尤其是針對一些較長片段的刪除、插入這種復(fù)雜的編輯類型。”論文第一作者、高彩霞課題組博士生劉怡靜向《中國科學(xué)報》解釋。
這些短板嚴(yán)重限制了引導(dǎo)編輯在植物中的廣泛應(yīng)用。因此，如何優(yōu)化引導(dǎo)編輯系統(tǒng)突破現(xiàn)有的限制，提升引導(dǎo)編輯技術(shù)的高效性、廣適性是一個研究重點。
尋找更高效“突破點”
萬事開頭難。如何去優(yōu)化引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)更高效、廣適的編輯呢？這是合作團(tuán)隊一直思考的問題。為此，他們先后構(gòu)思嘗試了多種不同策略，最終通過對蛋白的理性設(shè)計獲得了能夠穩(wěn)定提高效率的ePPE的版本。
不同于大多數(shù)已報道的通過優(yōu)化pegRNA提高引導(dǎo)編輯效率的思路，新型引導(dǎo)編輯系統(tǒng)ePPE側(cè)重于對引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的蛋白組分進(jìn)行改造。通過對不同策略構(gòu)建的多種引導(dǎo)編輯系統(tǒng)進(jìn)行篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)刪除引導(dǎo)編輯系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT（依賴RNA的DNA聚合酶）的RNA核酸酶H（RNase H）結(jié)構(gòu)域或在M-MLV RT 的N端融合病毒核衣殼蛋白（NC），可分別將PPE的編輯效率提高2.0倍和3.2倍。
究其原因，他們推測，RNase H結(jié)構(gòu)域的去除穩(wěn)定了sgRNA-DNA和nCas9-RT-pegRNA復(fù)合體中的RNA-DNA異源雙鏈結(jié)構(gòu)，NC蛋白通過其核酸退火活性在逆轉(zhuǎn)錄過程中輔助MLV-RT發(fā)揮功能。
研究人員進(jìn)一步地通過整合以上兩種優(yōu)化策略，開發(fā)出了升級版新型引導(dǎo)編輯器ePPE。相比于PPE，ePPE在堿基替換、小片段插入、刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下編輯效率平均可提高5.8倍，且不增加脫靶及副產(chǎn)物的發(fā)生。
“ePPE作為一個更高效、廣適的引導(dǎo)編輯器，可以算作是一支流暢合格的‘鉛筆’，一塊干凈好用的‘橡皮’了。”劉怡靜表示。
對此，另一位審稿人也表示：“這項研究在植物基因組編輯領(lǐng)域做出了及時而重要的貢獻(xiàn)。”
種質(zhì)創(chuàng)新“小試牛刀”
除了高效和廣適性，合作團(tuán)隊通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把新型引導(dǎo)編輯器ePPE與該課題組此前報道的dual-pegRNA策略和哈佛大學(xué)、博德研究所教授劉如謙實驗室研發(fā)的epegRNA策略相結(jié)合時，可進(jìn)一步提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在內(nèi)源基因上進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的效率。
這些特性在很大程度上拓展了其應(yīng)用范圍?；诖?，研究人員利用ePPE系統(tǒng)成功創(chuàng)制了對兩種除草劑（甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆）具備抗性的水稻新材料。
劉怡靜介紹，乙酰乳酸核酶（OsALS）基因是支鏈氨基酸合成途徑中的第一個酶，諸如磺酰脲類、咪唑啉酮、三唑嘧啶等除草劑都是該酶的抑制劑，通過抑制支鏈氨基酸的合成導(dǎo)致植物死亡，從而除去很多雜草。同時，這類除草劑對哺乳動物毒性非常小，應(yīng)用價值很高。
“通過在ALS基因的特定位置上產(chǎn)生單個氨基酸的突變，可以獲得抗性酶，賦予植物這一類除草劑抗性。”她表示，研究團(tuán)隊選擇了Trp548Met突變作為目標(biāo)靶點，該位點突變雖然可通過傳統(tǒng)誘變的方法獲得，但耗時耗力，需要巨大的工作量。而使用基因編輯方法不存在像誘變產(chǎn)生的其他有害突變，沒有脫靶，也無需回交，突變體植株可快速投入應(yīng)用生產(chǎn)。
研究人員在這一位點將編碼色氨酸的“TGG”密碼子修改為編碼甲硫氨酸的密碼子“ATG”，通過“鉛筆”+“橡皮擦”，同時實現(xiàn)“T到A”和“G到T”的突變。據(jù)介紹，這是目前引導(dǎo)編輯外的其他編輯工具所不能實現(xiàn)的。最終他們以高出原始引導(dǎo)編輯器PPE 5.6倍的效率成功獲得了抗除草劑的水稻新材料，并且在甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆兩種除草劑的篩選下有非常好的抗性表型。
“我國雖然在動植物基因編輯技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用上居于世界前列，但原始專利嚴(yán)重缺位，核心專利及底層技術(shù)大多被美國為首的西方國家壟斷，產(chǎn)業(yè)安全面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)，加快推動基因組編輯基礎(chǔ)研究是國家發(fā)展和戰(zhàn)略布局的迫切需求。”論文共同通訊作者、遺傳發(fā)育所研究員曹曉風(fēng)院士在接受《中國科學(xué)報》采訪時曾說。
而新系統(tǒng)的開發(fā)有望推動引導(dǎo)編輯在農(nóng)業(yè)育種、作物改良等方面的應(yīng)用。“我們也期待有更加流暢的‘彩筆’不僅可以實現(xiàn)更長片段的精準(zhǔn)改寫，也可以精致的繪制改寫基因組上的修飾，畫出‘彩色’的基因組信息。”劉怡靜說。
植物高效新型引導(dǎo)編輯器ePPE的建立及應(yīng)用。a-b，原生質(zhì)體報告系統(tǒng)篩選候選植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)。c，基于刪除RNase H結(jié)構(gòu)域和融合NC蛋白兩種策略構(gòu)建的引導(dǎo)編輯器與PPE編輯效率對比。d, ePPE示意圖。e，四種不同引導(dǎo)編輯器編輯效率對比。f，ePPE與已報道pegRNA優(yōu)化策略結(jié)合的編輯效率對比。g，ALS-W548M水稻突變體在不同除草劑處理下的表型。作者供圖
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