近日，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄧子新團(tuán)隊(duì)合作于《自然通訊》（Nature Communications）雜志上發(fā)表題為 “聚酮合酶的碳-氮鍵形成”（C-N bond formation by a polyketide synthase）的研究論文。上海交大博士后王嘉良、上海佶凱星生物科技有限公司汪小杰、上海交大碩士李希希、國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）孔亮亮、上海交大碩士生杜澤乾和博士生李丹丹為該論文共同第一作者。上海交大林雙君教授、石婷研究員、鄧子新教授、汪志軍副研究員和梁晶丹副研究員為共同通訊作者。
(資料圖片僅供參考)
該工作通過(guò)組合分子遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)模擬等多種技術(shù)手段，鑒定并重構(gòu)鈣霉素合成途徑中聚酮合酶CalA3催化的C-N鍵形成現(xiàn)象，解析CalA3與底物、產(chǎn)物的高分辨復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，深入推動(dòng)次生代謝巨型蛋白質(zhì)機(jī)器的生物化學(xué)與結(jié)構(gòu)研究，為理解聚酮合酶新穎的C-N鍵形成機(jī)理、衍生新型藥物提供理論基礎(chǔ)。
聚酮合酶（PKSs）是自然界中一系列強(qiáng)大的多功能酶，能夠合成具有廣泛生物活性的天然產(chǎn)物，包括：抗生素，降膽固醇藥，抗腫瘤藥以及免疫抑制劑。由于其具有功能多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)，探究PKSs的基本催化機(jī)制一直是微生物天然產(chǎn)物合成，進(jìn)而衍生新型藥物的研究焦點(diǎn)之一。
通常情況下，聚酮合酶遵守著相同的基本合成原理：催化C-C鍵的形成。然而，在抗生素鈣霉素合成途徑的聚酮鏈釋放步驟，存在一種潛在的、未被鑒定的C-N鍵形成現(xiàn)象。關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題亟待進(jìn)一步回答：（1）哪個(gè)酶負(fù)責(zé)催化C-N鍵的形成？該酶整體組織架構(gòu)怎樣，與其家族成員有何異同？（2）經(jīng)典的形成C-C鍵的聚酮合酶如何催化C-N鍵的形成？（3）關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)氨基酸如何進(jìn)行底物的識(shí)別、縮合以及聚酮鏈終產(chǎn)物的釋放？
針對(duì)上述關(guān)鍵性問(wèn)題，研究人員首先通過(guò)體內(nèi)敲除實(shí)驗(yàn)，論證了聚酮合酶CalA3負(fù)責(zé)催化鈣霉素聚酮鏈釋放步驟中C-N鍵的形成。隨后運(yùn)用冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術(shù)，成功解析3.38 ?的CalA3高分辨結(jié)構(gòu)（圖1）。CalA3整體呈現(xiàn)“∞”型的二體構(gòu)架，分為上、下兩個(gè)部分。上半部分“結(jié)構(gòu)區(qū)”，包含DH-KR（脫水酶-酮還原酶）結(jié)構(gòu)域，下半部分“催化區(qū)”，包含DD-KS-AT（對(duì)接-酮脂酰合酶-乙酰轉(zhuǎn)移酶）結(jié)構(gòu)域。
圖1. 聚酮合酶CalA3的整體構(gòu)架
結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱的CalA3上、下兩個(gè)區(qū)域緊密相互作用，互作面積達(dá)到~2842 ?2（圖2）。DD結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)水平、垂直的兩種截然不同的構(gòu)象；AT、DH、KR結(jié)構(gòu)域由于缺失活性位點(diǎn)氨基酸、或底物通道被堵塞、或輔因子結(jié)合序列丟失等原因，無(wú)法執(zhí)行其應(yīng)有的功能。它們組成了一個(gè)分子量巨大的“蓋子”，以非酶促的方式起到穩(wěn)定整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。
圖2. 結(jié)構(gòu)域間的相互作用以及非酶結(jié)構(gòu)域的特征
CalA3真正的催化活性隱藏在KS結(jié)構(gòu)域里（圖3）。通過(guò)體外重構(gòu)成功鑒定了KS結(jié)構(gòu)域催化聚酮鏈模擬底物SNAC-N1與輔因子3-HAA（三羥基鄰氨基苯甲酸）之間的縮合反應(yīng)，核磁共振確定了形成C-N鍵或水解并被釋放的兩個(gè)終產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；點(diǎn)突變測(cè)活鎖定了關(guān)鍵的活性位點(diǎn)氨基酸C197-H332-H372催化三聯(lián)體。
圖3. CalA3 KS結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能
為深入探究CalA3-KS的C-N鍵催化機(jī)制，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)催化過(guò)程進(jìn)行了初步的預(yù)測(cè)；運(yùn)用冷凍電鏡進(jìn)一步捕獲了CalA3與兩種終產(chǎn)物的高分辨復(fù)合物結(jié)構(gòu)（圖4），最終揭示了CalA3-KS的精確催化機(jī)制：在聚酮鏈進(jìn)入KS的底物通道后，C197對(duì)其硫酯鍵發(fā)動(dòng)親核攻擊，形成酰化狀態(tài)。H332從輔因子3-HAA的氨基上獲取一個(gè)氫，作為廣義堿再次發(fā)動(dòng)親核攻擊，最終形成C-N鍵并釋放終產(chǎn)物或通過(guò)水解反應(yīng)釋放終產(chǎn)物。此外，在形成碳四面體中間產(chǎn)物時(shí)，H372、K367、L437和L439巧妙地穩(wěn)定了輔因子3-HAA，起定位作用。
圖4. CalA3 KS結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制
CalA3緊致并高度對(duì)稱的整體構(gòu)架與其家族的其他PKSs差異巨大。通過(guò)人工智能AlphaFold2預(yù)測(cè)了合成雷帕霉素、FK-506以及兩性霉素的16個(gè)PKSs的完整結(jié)構(gòu)（圖5）。與CalA3相反，這些PKSs通過(guò)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)搖擺、創(chuàng)造非對(duì)稱的催化腔體，實(shí)現(xiàn)上述免疫抑制劑和抗生素的生物合成。
圖5. CalA3與功能性聚酮合酶的構(gòu)架對(duì)比及預(yù)測(cè)
綜上所述，研究人員解析了一個(gè)擁有罕見構(gòu)架的聚酮合酶CalA3的完整結(jié)構(gòu)，揭示CalA3催化的C-N鍵的形成機(jī)制。關(guān)鍵的“催化”氨基酸與“定位”氨基酸通力合作，實(shí)現(xiàn)新穎的C-N鍵的形成和終產(chǎn)物的釋放。CalA3與同家族PKSs的細(xì)致結(jié)構(gòu)對(duì)比，則為工程化改造聚酮合酶，合成創(chuàng)新藥物提供重要的基礎(chǔ)理論依據(jù)。
華北理工大學(xué)副教授茍麗霞、上海交大博士吳昊、博士生曹衛(wèi)、博士后王曉政參與了該項(xiàng)工作。感謝國(guó)家蛋白質(zhì)中心王芳芳、辛立輝、李光一、段佳琳、劉娜等老師的技術(shù)支持。感謝上海交通大學(xué)超算中心π 2.0集群提供的平臺(tái)及技術(shù)支持。
該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家博士后科學(xué)基金以及上海市超級(jí)博士后激勵(lì)計(jì)劃的經(jīng)費(fèi)支持。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36989-w
標(biāo)簽：
